Unterschiede zwischen unserem MoFlo and dem FACSAria II:
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MoFlo
Das MoFlo ist modular und flexibel. Deshalb können wir das MoFlo durch physikalischen Umbau den biologischen Problemen anpassen. Für die Benutzer ist die optische Justierung des MoFlos zu kompliziert. Zum Sortieren ist eine Bedienunperson notwendig. Das MoFlo hat eine geringere Fluoreszenz- auflösung als der FACSAria entsprechend der “stream in air“ Messung. In der Praxis ist es möglich, mit dem MoFlo um 50 % schnellere Zellsortierungen durchzuführen als mit dem FACSAria. An unserem MoFlo haben wir eine starke (100 mW) echte (355 nm) UV-Anregung. Das MoFlo ist gut geeignet, große und fragile Zellen zu sortieren. Das Flußsystem des MoFos ist einfach steril zu halten. |
FACSAria II
Der FACSAria II hat einen festen Aufbau. Deswegen kann die Anregungswellenlänge und Intensität der Laser nicht verändert werden. Der FACSAria II ist einfach ziu benutzen. Es ist nicht aufwändig, die Düse zu wechseln. Der FACSAria II kann von angelernten Benutzern bedient werden. Für kleine Zellen und sichtbare Lichtanregung hat der FACSAria II ausgzeichnete Fluoreszenzauflösungen. Zellsortierungen mit dem FACSAria II sind langsamer als mit dem MoFlo. Der FACSAria II hat einen hohen Zellverlust. Der FACSAria II hat nur eine UV-nahe (375 nm) und sehr schwache (7 mW) Lichtanregung. Speziell für große Zellen ist die Auflösung schlecht. Die Side Population (SP) kleiner, nichtadhärenter, kompakter Zellen kann mit dem FACSAria gemessen werden (siehe Beispiele). Große adhärente Zellen werden geschädigt oder getötet bei der Sortierung mit dem FACSAria II. Bei großen abtrypsinierten Zellen hat der FACSAria II eine sehr schlechte Scatter-Auflösng. Es ist unkompliziert, den FACSAria II steril zu halten. |
Vergleich der Vitalität sortierter K562-Zellen:
Die K562-Linie besteht aus nicht-adhärenten runden Zellen mit einem Durchmesser von ca. 15 µm. Vor dem Sortieren waren 3 % der Zellen tot. Nach Propidium Jodid (PI) -Färbung, wurden die vitalen K562-Zellen mit dem MoFo und dem FACSAria heraussortiert. Die sortierten Zellen wurden wieder mit PI gefärbt und reanalysiert, um die Vitalität der mit dem MoFlo bzw. dem FACSAria sortierten Zellen zu verglichen.
| Reanalyse der am MoFlo im "high speed mode" sortierten K562-Zellen : | Reanalyse der am FACSAria im "high speed mode" sortierten K562-Zellen : |
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MoFlo: Düse: 70 µm, Druck: 60 psi, Hüllstrom: Hanks BSS, cell counting beads |
FACSAria: Düse: 70 µm, Druck: 70 psi, Hüllstrom: Hanks BSS, cell counting beads |
| Reanalyse der am MoFlo im "low speed mode" sortierten K562-Zellen : | Reanalyse der am FACSAria im "low speed mode" sortierten K562-Zellen : |
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MoFlo: Düse: 100 µm, Druck: 20 psi, Hüllstrom: Hanks BSS, cell counting beads |
FACSAria: Düse: 100 µm, Druck: 20 psi, Hüllstrom: Hanks BSS, cell counting beads |
Kulturzellen wie die K562-Linie sollten mit dem MoFlo und nicht mit dem FACSAria sortiert werden!
Wann sollte der Fluoreszenz-aktivierte Zellsorter Massenanreicherungsmethoden wie Panning, Elutriation oder einer Separation mit magnetischen oder paramagnetischen Beads vorgezogen weden ?
- Wenn eine sehr große Reinheit (98%-100%) der Zielpopulation erforderlich ist.
- Wenn Populationen getrennt werden müssen, die eine sehr geringe Rezeptordichte auf ihrer Oberfläche haben.
- Bei Tennungen von Populationen aufgrund der Rezeptordichte.
- Bei Sortierungen nach vielen Farben.
- Bei Separationen auf der Basis von zellinternen Färbungen wie DNA, interne Antigene oder aufgrund exprimierter fluoreszenter Proteine.
- Wenn Einzelzellsortierungen gefragt sind, z.B. bei Klonierungen oder bei der Einzelzell-PCR.
- Wenn alle anderen Anreicherungsmethoden versagen.
Nach welchen biologischen Parametern können die Zellen angereichert werden ?
Nach Zelleigenschaften, die mit Fluoreszenzfarbstoffen dargestellt werden können wie z.B.
- Protein Expression,
- DNA Gehalt,
- Zellfunktion
- oder anderen anfärbbaren Zelleigenschaften.
- Aber auch Steulicht
- und Kombinationen aus den einzelnen Parametern.
Welches sind die meist verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe für das Sortieren ?
- Bei der Immunophänotypisierung mit bis zu 9 Farben z.B. FITC, PE, CY5, Cascade Blue, Amca, APC, TR und die Tandemfarbstoffe mit PE und APC.
- Bei der Expression fluoreszenter Proteine z.B. e-BFP, e-CFP, e-GFP, e-YFP oder DS-Red.
- Bei der Zellteilungz.B. BUdR/Hoechst, CFSE oder PKH26
- Zellzyklus und Ploidie z.B. PI, Hoechst-Farbstoffen oder DAPI.
- Bei der Kalzium-Mobilisierung z.B. Indo-1
- Apoptose: Sortierung des Sub-diploiden Peaks oder Annexin V-Markierung
Was kann mit sortierten Zellen gemacht werden ?
- Z.B. Zellkultur, stabile Zellinien,
- DNA-Analysen, PCR,
- RNA-Analysen, FISH, Micro-Array-Analysen,
- morphologische Untersuchungen mit dem Mikroskop,
- Protein Extraktion, Western Blots,
- DNA Analysen, PCR,
- Zellklonierung,
- oder Zellanreicherungen für funktionelle Tests.
Werden die Zellen durch den Sortiervorgang geschädigt ?
Im allgemeinen werden die Zellen durch den Sortiervorgang nicht geschädigt, wenn die Temperatur und der PH-Wert stimmen und das Medium für die Zellen geeignet ist. Meist sind mehr als 95% der Zellen nach der Sortierung intakt.
Schon vorgeschädigte Zellen sind bei der Sortierung anfälliger für Schädigungen als vollkommen intakte Zellen. Was aus dem Sorter herauskommt, ist mit dem sehr ähnlich, was in den Sorter hineingegeben wurde!
Geschätzte Sortierzeiten:
Die Einstellzeit des MoFlos beträgt 90 Minuten, das Herunterfahren des Gerätes nach der Sortierung dauert weitere 15 Minuten. Deswegen versuchen wir so viel Sortierungen wie möglich direkt nacheinander durchzuführen.
Die Dauer des reinen Zellseparationsprozesses hängt von der Ausgangszellzahl ab und nicht von der Anzahl der benötigten sortierten Zellen. Durchschnittliche Sortiergeschwindigkeiten:
adhärente Zelllinien: ~30 Millionen Ausgangszellen/h
Blutzellen/Thymozyten: ~100 Millionen Ausgangszellen/h.
Das Sortieren von 10 Millionen Zellen dauert mit Ein- und Ausstelllen des Sorters ungefähr 2h, von 100 Millionen Zellen etwa 3-5 Stunden.
Die aktuelle Sortierzeit ist sehr abhängig von der Zellkonzentration, weil nur ein bestimmtes Probenvolumen pro Zeiteinheit durch den Sorter laufen kann, wenn die Strömung laminar bleiben soll. Da tote Zellen und Zellschrott auch als Ereignisse gewertet werden, verlängert ihre Aussortierung den Sortiervorgang unnötig.
Wonach kann eine Sortierung optimiert werden ?
- Reinheit
- Recovery
- genaue Zellzahl
Reinheit der sortierten Zellen:
Die maximale Reinheit der sortierten Zellen beträgt 99% bis 100%. Sie kann in einem Sortierschritt erreicht werden, wenn die Zielzellpopulation grösser als 10% ist. Die Sortierreinheit übersteigt im allgemeinen 95% wenn die Zielzellpopulation größer als 1% ist.
Die Reinheit der sortierten Fraktion hängt von der Qualität der Probe und den Sortierparametern ab. Allgemein ist die Reinheit um so kleiner, je grösser die Ausbeute sein soll. Weiter hängt die Reinheit stark von der Stabilität der Flußzytometers ab. Die Stabilität des Sorters ist wesentlich von der Nichtanwesenheit von Schlamm aus zerfallenden Zellen abhängig.
Zellausbeute:
50% Recovery ist ein vernünftig angenommener Mittelwert, aber der aktuelle Prozentsatz der Zellen, die wiedergefunden werden hängt von vielen Faktoren ab:
Kann man eine Population von weniger als 1% heraussortieren oder müssen die Zellen vorher angereichert werden?
Ja, seltene Ereignisse unter 1% Zielzellen können sortiert werden, aber darunter leidet die Reinheit und die Ausbeute. Deswegen sollte die Konzentration der Zielzellen, wenn möglich, vorher durch Massenanreicherungsmethoden oder durch eine vorausgehende Anreicherungssortierung erhöht werden.
In welche Gefäße kann sortiert werden ?
Das Volumen eines sortierten Tropfens beträgt ca. 1,4 nl. Einzelne Tropfen trocknen in Sekunden aus.
Deswegen sollte, vorallem bei wenig zu erwarteten Zellen, 1-2 ml Serum oder ewas, worin sich die Zellen wohlfühlen, in die Sortiergefäße vorgelegt werden.
